Résumé- Les plantes médicinales à propriétés anthelminthiques constituent une alternative à la lutte chimique contre les nématodes gastro-intestinaux des petits ruminants. Dans l'objectif d'élargir le spectre des plantes médicinales à propriétés anthelminthiques, une évaluation de l'activité ovicide et d'inhibition du dégainement des larves L3 de H contortus, des extraits aqueux de C. sesamoïdes Endl et S. hermonthica (Deli.) Benth a été effectuée. Trois concentrations, 3,12 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml de chaque extrait de plante ont été utilisées pour évaluer l'inhibition de l'éclosion des œufs frais et de paralysie larvaire ainsi que l'inhibition du dégainement des larves L3. Un Témoin négatif (PBS1x) et un témoin positif (lévamisole, 2,5 mg/ml) ont été constitués pour l'évaluation de l'inhibition de l'éclosion alors que seulement le témoin négatif (PBS1x) a été constitué pour évaluer l'inhibition du dégainement des larves L3. 1 ml de chaque concentration a été mise en contact avec 1 ml de la solution d'œufs puis incuber pendant 48 heures à 27° C dans des boîtes de pétri (60X15 Cm) pour le test de l'inhibition de l'éclosion. 1 ml de chaque concentration d'extrait a été mise en contact avec 1 ml de la solution d'œuf embryonné après 24 heures d'incubation à 27° C pour le test sur la paralysie larvaire. 1 ml de la solution larvaire a été mise en contact avec 4 ml de chaque concentration de la solution d'extrait pendant 3 heures pour l'inhibition du dégainement des larves L3. Les résultats ont montré une inhibition de l'éclosion de 53,89% à la concentration de 12,5 mg/ml avec C. sesamoïdes Endl approximativement au témoin positif (Lévamisole) 56,49% alors que celui du S. hermonthica n'a été que de 40,72%. Le taux de paralysie larvaire a été de 51,11% et 60,56% respectivement pour S. hermonthica (Deli.) Benth et

C. sesamoïdes Endl. L'inhibition du dégainement pour l'extrait aqueux de C. sesamoïdes Endl est de 65,33% à 12,5 mg/ml et 64% à la même concentration pour S. hermonthica (Deli.) à Benth après 60 minutes.

I. INTRODUCTION

Haemonchus contortus est l'un des nématodes gastro-intestinaux qui cause la plus importante contrainte dans l'élevage des petits ruminants (Mangi et al, 2006). En effet, la faune parasitaire du tractus digestif des petits ruminants est dominée par H. contortus de par sa fréquence et son intensité (Koné et al, 2005; Dedehou et al, 2014; Koffi et al, 2018). Comparativement aux autres espèces de nématodes, H. contortus est le parasite des petits ruminants le plus pathogène capable de provoquer des maladies aiguës et des fortes mortalités dans toutes les catégories des petits ruminants (Akkari et al, 2013; MbogningTayo et al, 2014). Ce parasite hématophage peut causer une anémie conduisant à la réduction de la productivité chez les petits ruminants (Burke et al, 2007).

La gestion des nématodes gastro-intestinaux des petits ruminants repose fortement sur l'utilisation des anthelminthiques de synthèses (Chartier et al, 2014). L'utilisation répétée de ces anthelminthiques de synthèse a entrainé l'apparition des résistances irréversibles des parasites à la majorité des familles des molécules anthelminthiques (Apala et al, 2020). Aussi, en plus de la difficulté d'accès de ces molécules anthelminthiques de synthèse aux éleveurs ruraux, il faut ajouter l'écotoxicité de ces molécules pour l'environnement (Dedehou et al, 2014).

Face à cette situation différentes alternatives aux molécules anthelminthiques dans le traitement des nématodes gastro-intestinaux sont envisagées. Parmi ces solutions alternatives il y a l'utilisation des plantes fourragères à propriétés anthelminthiques.

L'objectif de cette présente étude est d'évaluer in vitro l'activité ovicide et inhibitrice du dégainement des larves L3 de H. contortus des extraits aqueux du Strigahermonthica (Del.) Benth et de C. sésamoïdes Endl.

II. MATÉRIEL ET MÉTHODE

a) Milieu d'étude

Les tests in vitrode l'évaluation de l'activité ovicide et inhibitrice du dégainement larvaire ont été réalisés au Laboratoire de Biologie et santé Animale (LaBioSA) du Centre de Recherches Environnementales, Agricoles et de Formation (CREAF) de Kamboinsin.

b) Récoltes des plantes

Cératothéca sésamoïdes Endl et Striga hermontica (Delile) Benth ont été récoltées puis séchées à l'ombre entre fin Septembre et mi-octobre dans une salle à la température ambiante à la Direction Régionale de la Recherche Environnementale et Agricoles (DRREA-Sahel). Les plantes ont été identifiées à l'Herbier National du Burkina Faso (HNBF) respectivement sous les numéros 8758 et 8759.

c) Préparation des extraits

Les plantes entières des deux espèces ont été récoltées tôt le matin et séchées dans une salle à la DRREA-Sahel à la température ambiante pendant 2 semaines et acheminées au CREAF de Kamboinsin par la suite. Les échantillons de chaque plante ont été par la suite broyés en poudre. Une macération aqueuse (100 g de poudre dans 900 ml d'eau distillée) a été effectuée pendant 24 heures sous agitation mécanique à la température ambiante. Les macérations ont été ensuite filtrées et concentrées au congélateur. Les filtrats concentrés ont été par la suite lyophilisées.

d) Tests biologiques

i. Préparations des solutions mères

Les solutions mères de chaque extrait ont été préparées en diluant 0,25 g d'extrait de chaque plante dans 10ml du PBS 1X pour obtenir 25mg/ml de concentration pour chaque extrait. La solution a été homogénésée à l'aide d'un sonicateur pendant 3 minutes. A partir de la solution mère trois autres solutions de concentrations inférieures qui seront utilisées à savoir 12,5 mg/ml et 6,25mg/ml et 3,12 mg/ml de chaque extrait ont été réalisées. Le lévamisole (anthelminthique de référence) à 2,5 mg/ml et PBS 1X ont été utilisé respectivement comme témoins positif et négatif.

ii. Récoltes des œufs

Les œufs ont été obtenu selon la méthode décrite par Kaboré. (2009). Tout d'abord, Les vers adultes ont été récoltés sur des caillettes des ovins fraichement abattus à l'abattoir de Kamboinsin. Ensuite, les femelles ont été triées puis enfin broyées légèrement dans un mortier en porcelaine. Le broyat a été filtrées avec des tamis de mailles décroissantes de 55 μm et 25 μm. La solution d'œufs obtenue a été réajustée à 100 œufs par millilitre.

iii. Obtention et Récoltes des larves infestantes L3

Les larves L3 ont été obtenues en cultivant pendant 14 jours à 31° C les œufs dans des fèces d'ovins préalablement stérilisés à l'étuve à 130° C pendant 24 heures et mélangés avec de la sciure du bois. Après 14 jours la culture a été montée dans un gaze puis déposé sur le dispositif de Baermann pour récolter les larves L3. La solution larvaire obtenue a été mise dans un bécher et déposée au congélateur pendant 3 heures. Les larves ayant migrées au fond ont été récupérées et centrifugées trois fois à 2000 trs/mns pendant 10 mns. La solution larvaire a été ensuite réajustée à 2000 larves/ml.

iv. Test d'inhibition de l'éclosion

Le test d'inhibition de l'éclosion a été réalisé selon la méthode modifié de Kaboré. (2009). 1 ml de la solution larvaire réajustée à 100 œufs/ ml a été mise en contact avec 1 ml de chaque concentration d'extraits dans une boîte de pétri (60X15 Cm) puis incubé pendant 48 heures à 27° C. Après 48 heures quelques gouttes de lugol ont été ajoutées dans chaque boîte de pétri pour stopper l'évolution des œufs.

Le test a été répété trois fois avec trois réplicas pour chaque concentration par répétition.

Le nombre de larve et d'œufs non-éclos ont été évalués en déposant 50 $\mu$ l entre lame et lamelle et observant au microscope à l'objectif X10.

Le pourcentage d'inhibition de l'éclosion des œufs a été calculé selon la formule suivante (Kaboré, 2009):

X1: Nombre d'œufs éclos dans les extraits testés

X2: Nombre d'œufs éclos dans le témoin négatif

v. Test d'embryonnement

Le test d'embryonnement a été réalisé selon la méthode modifiée de Waboponé et al. (2006) décrite par Kaboré. (2009). 1ml de la solution d'œuf à 100 œufs/ml a été incubé dans des boîtes de pétri (60X15 Cm) à 27° C. 24 heures après, lorsque les larves L1 ont été transparentes et ont commencé à se mouvoir dans les enveloppes des œufs, 1 ml de chacune des concentration test de chaque extrait a été ajouté dans chacune des boîtes de pétri constituant le lot test. 1 ml du PBS 1X et 1 ml de lévamisol à 2,5 mg/ml ont été ajouté dans les boîtes de pétri pour tenir respectivement de témoin négatif et témoin positif. Après 6 heures de contact des extraits et des œufs embryonnés quelques gouttes de lugol ont été ajoutées dans chaque boîte de pétri pour stopper l'évolution des œufs.

e) Analyse des données

Les données ont été saisies sur le logiciel Excel 2016 qui a servi aux calculs des moyennes et Ecart Type. Les moyennes du taux d'inhibition des éclosions ainsi que celles du taux de paralysies larvaires et du dégainement larvaire ont été comparées à l'aide d'une analyse de variance (ANOVA) à une voie suivi d'une comparaison multiple de moyenne au seuil de 5% avec le Packages Rcmdr version 2.7-1 du logiciel R version 4.1.0.

Une régression linéaire par la méthode probit a été effectuée avec le logiciel SPSS STATISTICA 26 afin de déterminer les concentrations inhibitrices 50% de l'éclosion des œufs et celle qui engendre la paralysie larvaire des œufs embryonnées de 50%.

Le logiciel PRISM GraphPad Software 5.00.288 nous a servi de tracer les graphiques doses-réponses

Le test a été réalisé en trois répétition avec 3 réplicas pour chaque répétition.

Le taux de paralysie larvaire (TPL) a été déterminé selon la formule de D'Angelo et al. (2014):

Nombre de Larves L1

TPL = 100-[(____)*100]

Nombre d'œufs embryonnés

vi. Test d'inhibition du dégainement larvaire

Le test de dégainement des larves L3 a été effectué selon la méthode décrite par Par Zabré. (2018) combiné à celle de Okombé.(2011) et Marion.(2015).

En plus des trois concentrations (3,12mg/ml; 6,25mg/ml; 12,5mg/ml) des extraits de chaque plante, et un témoin négatif (PBS) réalisées précédemment, une solution dite de Milton (javel 2,6% dilué dans du Nacl 0,9% au 1/300) a été réalisée.

1 ml de la solution larvaire a été incubé avec 4 ml de la solution d'extrait pendant 3h dans des boîtes de pétri (60X15Cm) et agité chaque 30 minute. Après 3h, 200 μl ont été prélevés de chacune des boites de pétri et mis en contact avec 200 μl de la solution de milton dans un tube eppendorf 2 ml. Le test a été répété 3 fois.

La cinétique de dégainement a été suivie au microscope X20 aux temps, T0, T20, T40 et T60mns après contact avec la solution de Milton en mettant 50 $\mu$ l entre et lamelle et en comptant les larves dégainées et engainées.

Le pourcentage des larves dégainées a été calculé selon la formule suivante:

Nombre de larves dégainées

Nombre total de larves de l'évolution du dégainement des larves L3 en fonction du temps.

III. RÉSULTATS

Pourcentage d'inhibition de l'éclosion des CEufs
Répétitions	Doses(mg/ml) /Extrait aqueux du Shermonthica(Del.) Benth					Doses (mg/ml) /Extrait aqueux C.sésamoïdesEndl
	3,12	6,25	12,5	T(-)	T(+)	3,12	6,25	12,5	T(-)	T(+)
R1	23,08	46,16	38,46	0	53,84	1,86	22,22	50	0	48,16
R1	5,88	21,58	52,94	0	64,71	17,65	29,41	60,79	0	42,35
R 3	15,38	23,08	30,76	0	53,84	21,05	22,81	50,88	0	78,95
Moyenne ±σ	14,78±8,61ab	30,27±13,78bc	40,72±11,26cd	0a	57,46±11,26d	13,52±10,24a	24,81±3,99a	53,89±5,99b	0a	56,49±19,67b

	R2 d'ajustement	a	b	CI50
C. sesamoïdesEndl	0,97	2,15	1,99	11,83 mg/ml
S. hermonthica (Deli.) Benth	0,87	1,19	0,08	14,93 mg/ml

Le tableau 1 montre l'effet des extraits aqueux des plantes testées sur l'inhibition de l'éclosion des œufs de H. contortus.

L'analyse de ce tableau nous indique que les extraits aqueux des plantes testées ont une activité inhibitrice de l'éclosion des œufs moyenne voire faible. En effet, on remarque une activité inhibitrice légèrement supérieure ou égale à 50% de l'éclosion des œufs seulement à la dose la plus élevée qui est de 12,5 mg/ml. Aussi seulement l'extrait aqueux de C. sesamoïdes Endl a obtenu un taux moyen d'inhibition de 53,89% alors que celui de l'extrait aqueux du S. hermonthica (Del.) Benth est de 40,72%. Ce tableau nous indique aussi une faible activité inhibitrice du lévamisole (témoin positif) qui est de 56,49% en moyenne pour le test avec l'extrait aqueux de C. sesamoïdes Endl et 57,46% en moyenne avec l'extrait aqueux du S. hermonthica (Deli.) Benth.

Le tableau 2 nous indique les valeurs de la droite de régression qui nous a permis d'obtenir les concentrations inhibitrices des extraits des deux plantes testées.

Pourcentage de paralysie larvaire des CEuls embryonines
	Doses(mg/ml) /Extrait aqueux du S hermonthica(Del.) Benth					Doses (mg/ml) /Extrait aqueux C. sésamoïdes Endl
Répétitions	3,12	6,25	12,5	T(-)	T(+)	3,12	6,25	12,5	T(-)	T(+)
R1	26,67	26,67	53,34	10	66,67	30	34,34	54,67	5	55
R1	20	20	46,67	10	60	36,67	32	60	0	60
R 3	33,34	33,34	53,34	15	73,34	26,67	35	67	10	80
Moyenne ±σ	26,67±6,67b	37,78±3,8bc	51,11±3,85c	11,66±2,88a	66,67±6,7d	31,11±5,09b	33,78±1,58b	60,56±6,12c	5±5a	65±13,23c

	R2 d'ajustement	a	b	CI50
C. sesamoïdesEndl	0,94	0,84	0,09	9,80 mg/ml
S. hermonthica (Deli.) Benth	0,97	0,79	0,07	11,79 mg/ml

Le tableau 3 nous indique l'effet des extraits aqueux de S. hermonthica (Deli.) Benth et de C. sesamoïdes Endl sur la paralasie larvaire des œufs embryonnées de H. contortus.

Ce tableau nous montre que les extraits aqueux des deux plantes testées ont un taux moyen d'activité de paralysie larvaire des œufs embryonnées de H. contortus. En effet, ce tableau nous indique un taux moyen de paralysie larvaire de 51,11% et 60,56% respectivement pour l'extrait aqueux du S. hermontica (Deli.) Benth et de celui de C. sesamoides Endl.

Nous remarquons un taux de paralysie larvaire de 11, 66% du lot témoin négatif (PBS1X) pour le test avec l'extrait aqueux du S. hermonthica (Deli.) Benth et 5% pour le test avec l'extrait aqueux de C. sesamoides Endl. Cependant, l'activité du témoin positif (lévamisole) n'a été que de 66,67% et 65% respectivement pour test avec S. hermonthica (Del.) Benth et C. sesamoides Endl. Le tableau 4 nous indique les valeurs de la droite de régression qui nous a permis d'obtenir les concentrations des extraits des deux plantes testées qui engendrent la paralysie larvaire de 50% des œufs embryonnés.

Extrait aqueux de C.sesamoïdes Endl Figure 1: Evolution du dégainement des larves L3 avec l'extrait aqueux de Ceratotheca sesamoides Endl en fonction du temps

La figure 1 nous montre l'évolution du dégainement en fonction du temps après contact avec la solution de Milton des larves L3 mises en contact avec les différentes concentrations de l'extrait aqueux de C. sesamoïdes Endl. La figure 1 nous montre une évolution similaire des courbes du dégainement des larves mises en contact avec le témoin négatif (PBS 1X) et celles mises en contact avec la dose 3,12 mg/ml. L'analyse de ce graphique nous indique aussi que les doses 6,25 mg/ml et 12,5 mg/ml de l'extrait aqueux de C. sesamoïdes Endl ont eu une inhibition de dégainement respectivement faible et moyenne des larves.

La comparaison multiple des moyennes du pourcentage de dégainement par la méthode de Tukeys montre une forte significativité entre la moyenne de pourcentage du dégainement des larves L3 au temps (T60) et les temps (T0) ainsi qu'au temps (T20) avec une probabilité p < 0,001 alors que la moyenne du pourcentage du dégainement des larves au temps (T60) et celle au temps (T40) n'a pas été très significative p < 0,011.

La figure 2 nous montre l'évolution du dégainement des larves L3 en fonction du temps après contact à la solution de Milton des larves L3 mises en contact avec les différentes concentrations de l'extrait aqueux du S. hermonthica (Deli) Benth. Ce graphique nous indique une évolution identique des courbes en fonction du temps de la moyenne de dégainement des larves L3 mises en contact avec les concentrations 3, 12 mg/ml, 6,25 mg/ml et celle mises en contact avec le témoin négatif (PBS 1X).

La comparaison multiple des moyennes par la méthode de Tukey montre une forte significativité entre les moyennes du pourcentage de dégainement du temps (T60) et (T20) ainsi qu'aux temps (T60) et temps (T0) P< 0,001. Par contre les moyennes du pourcentage du déagienement du temps (T20) et temps (T0) ainsi que temps (T40) et temps (T60) n'ont pas été très significatifs avec respectivement P< 0,011 et P< 0,028.

IV. Discussion

Les résultats de cette étude nous montrent que l'inhibition de l'éclosion des œufs de H. contortus est doses-dépendante avec les extraits aqueux de C. sesamoïdes Endl et S. hermonthica (Deli.) Benth. En effet, l'extrait aqueux de C. sesamoïdes Endl, a obtenu un taux d'inhibition évolutif en fonction de la concentration qui atteint une moyenne de 53,89% à la dose de 12,5 mg/ml. L'extrait aqueux du S. hermonthica (Deli.) Benth a aussi eu un effet inhibiteur évolutif en fonction de la concentration mais de moyenne faible n'atteignant pas 50% à la dose de 12,5 mg/ml. Par contre les extraits des deux plantes testées ont eu un effet inhibiteur et évolutif en fonction de la concentration qui atteint respectivement 51,11% pour S. hermonthica (Deli.) Benth et 60,56% pour C. sesamoïdes Endl. Koffi et al. (2018), ont eu des résultats similaires avec les extraits hydro-méthanoliques à 2000 μg/ml de sept (07) espèces parmi huit (08) dont seulement l'extraits hydro-méthanoliques du Morus mesozyna a eu un de taux d'inhibition de l'éclosion de 84, 08% alors que les sept (07) autres plantes ont eu des taux faibles allant de 5,65% avec Ficus lutea à 28, 08% pour Antiaris africana. Cette dissemblance de résultats avec l'extrait du Morus mesozyna serait due à la nature du solvant d'extraction car les métabolites secondaire extraits des plantes dépendent du solvant d'extraction. Ainsi, l'extraction aqueuse de nos plantes testées pourrait ne pas contenir les métabolite secondaire pouvant inhiber l'éclosions des œufs jusqu'à un tel pourcentage que celui du Morus mesozyna. Par contre le fait que les sept (07) autres plantes testées par ces auteurs n'ont pas eu 50% d'inhibition de l'éclosions pourrait aussi s'expliquer par la nature leurs solvant d'extractions et aussi par la résistance à des œufs de H. contortus qui sont naturellement très résistante. D'Angelo et al. (2014) ont aussi eu des résultats différents au notre avec les extraits methylene Chloro-méthanolique de l'écorcé du tronc de Annona senegalensis à différentes doses sur Heligmosomoïdes Bakeri. En effet, ces auteurs, ont obtenu un taux d'inhibition de l'éclosion des œufs de 16, 10% alors que le taux de paralysie embryonnaire des œufs embryonnées était de 20,80% à la dose la plus élevée qui est de 5000μg/ml. Cette différence de résultats serait due à la différence de l'espèce de nématode étudiée car notre présente étude porte sur H. contortus alors que leur étude à porte sur

Heligmosoïdes Bakeri. Aussi, cette différence pourrait être due à la différence des plantes utilisées et à la différence des solvants d'extraction qui favorisent la présence de certains métabolites secondaires que d'autres. Les extraits des feuilles de A. leiocarpus et des écorces du tronc de D. oliveri ont eu un effet dose-dépendant sur la paralysie des œufs embryonnés avec respectivement une Cl50 de 411,4 μg/ml pour A. leiocarpus et 362,3 μg/ml pour D. oliveri et une inhibition de l'éclosion des œufs de 100% pour les extraits aqueux de ces deux plantes (Kaboré, 2009). La différence d'efficacité de ces plantes avec celles des plantes utilisées dans notre présente étude pourrait être due à la nature des plantes utilisées. En effet, notre présente étude a porté sur des herbacées entières alors que cette étude a porté sur des feuilles et écorces de ligneux.

Cette présente étude nous montre à travers les résultats obtenus que les extraits aqueux de C. sesamoïdes Endl et ceux du S. hermonthica (Deli.) Benth ont une inhibition qui est dose-dépendante sur le dégainèrent des larves L3 de H. contortus. En effet, les figure 1 et 2 nous montrent une évolution similaire de la cinétique du dégainement des larves mises en contact avec le témoin négatif (PBS1x) et celles mises en contact avec la dose de 3,12 mg/ml. Par contre l'évolution des courbes des larves mises en contact avec le témoin négatif (PBS1x) et celles des larves mises en contacts avec la dose de 3,12 mg/ml est différente de celle des larves mises en contact avec la doses de 6,25 mg/ml et de celles des larves mise en contact avec la doses de 12,5 mg/ml dont l'évolution de l'inhibition du dégainement est juste au-dessus de 50%. Les extraits aqueux et méthanolique d'Acacia nilotica ainsi que A. raddiana ont obtenu une inhibition du dégainement des larves L3 mise en contact avec les doses de 1,2 mg/ml et 0,6 mg/ml qui atteint 100% d'inhibition (Zabré, 2018). La différence avec les résultats obtenus dans cette présente étude pourrait être due à la nature des plantes utilisées car notre présente étude a porté sur les herbacées entières alors qu'il s'agit des feuilles de ligneux dans l'autre étude.

Cette efficacité moyenne des extraits aqueux de C. sesamoïdes Endl et S. hermonthica (Deli.) Benth serait due à la présence de certains métabolites secondaires tels que les tanins et les flavonoïdes dans ces extraits aqueux. Cependant au vu de résultats d'inhibition de l'éclosion des œufs frais et des œufs embryonnés (paralysie larvaire) ainsi que celui du dégainement des larves L3 nous pouvons émettre l'hypothèse que la solution aqueuse ne permet pas d'extraire la dose suffisante à inhiber l'évolution des œufs et des larves à 100%.

V. CONCLUSION

La présente étude confirme que les extraits aqueux de C. sesamoïdes Endl, et S. hermonthica (Deli.)

Benth contiennent des composés bioactifs qui inhibe l'évolution des œufs et le dégainement des larves L3 de H. contortus. Cependant, du fait que l'inhibition de l'évolution des œufs et du dégainement des larves L3 n'atteint pas 100% nous laisse penser que la présence de ces composés bioactifs serait optimisée par un autre solvant d'extraction. Toutefois les extraits aqueux de C. sesamoides Endl et S. hermonthica (Deli.) Benth pourraient être employés comme désinfectant sur les pâturages pour interrompre le cycle évolutif des nématodes et diminuer ainsi la charge parasitaire des pâturages.